Do powołania placówki doszło 15 sierpnia 1997 r. na mocy dekretu bp. Kazimierza Górnego. Dyrektorem został mianowany ks. Franciszek Dziedzic, absolwent szkoły plastycznej w Jarosławiu. Muzeum zlokalizowane zostało w podziemiach kamienicy przy ul. Zamkowej 4, która była już wówczas siedzibą Kurii Diecezjalnej i Sądu Biskupiego. Ponad rok trwały intensywne prace nad pozyskaniem eksponatów, organizacją ekspozycji oraz opracowaniem merytorycznym zbiorów. Tego niełatwego zadania podjął się nowo mianowany dyrektor oraz Barbara Sierżęga, emerytowana pracowniczka Muzeum Okręgowego.

Uroczyste otwarcie Muzeum Diecezjalnego w Rzeszowie odbyło się 25 września 1998 r. w ramach rzeszowskich obchodów Europejskich Dni Dziedzictwa Kulturowego. W ciągu ćwierć wieku muzeum zorganizowało dziesiątki wystaw czasowych i wydarzeń o charakterze kulturalnym i popularnonaukowym.

Okazją do przywołania tej działalności były obchody jubileuszowe, które odbyły się 14 grudnia 2023 r. Rozpoczęły się one uroczystą Mszą św. w kościele Świętego Krzyża, celebrowaną przez bp. Kazimierza Górnego oraz ponad dziesięciu księży. W homilii ksiądz biskup wspomniał początki tworzenia muzeum oraz jego pracowników. Zaakcentował też, jak ważną rolę pełni sztuka w przekazie wiary chrześcijańskiej.

Dalszy ciąg obchodów odbył się w aulach Kurii Diecezjalnej, gdzie czekała już na zebranych wystawa „Muzeum odkryte” ukazująca nieprezentowane na co dzień obiekty. Obecny dyrektor ks. Paweł Batory zaprezentował album o muzeum wydany przez wydawnictwo diecezjalne Bonus Liber z okazji jubileuszu, dofinansowany z budżetu Gminy Miasta Rzeszów. Książka zawiera wspomnienie pracowników, historię kamienicy, omówienie wybranych zabytków z kolekcji oraz bogaty materiał fotograficzny z wernisaży i wydarzeń, jakie odbyły się w tych murach w ciągu ćwierćwiecza, a także wywiady z założycielem muzeum bp. Kazimierzem Górnym oraz panią Martą Nikiel, historyczką sztuki współpracującą z poprzednim i obecnym dyrektorem.

Wydarzenie zgromadziło liczną publiczność, w tym przedstawicieli instytucji kultury z Rzeszowa i okolic. Padło wiele ciepłych słów pod adresem muzeum, wybrzmiała również kwestia pilnej potrzeby znalezienia odpowiedniej siedziby dla placówki.

Kulminacją wieczoru było wręczenie osobom zasłużonym dla muzeum odznaczeń diecezjalnych „Bene merenti”. Otrzymali je historycy sztuki Marta Nikiel i Piotr Łopatkiewicz oraz artyści malarze Stanisław Białogłowicz, Łukasz Gil i Tomasz Baran.